La enfermedad de Chagas (EC) es causada por la infección con el parásito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi. La Organización Mundial de  la Salud estima que aproximadamente 8 millones de personas en Latinoamérica están infectadas. Sin embargo, debido a la creciente migración de  latinoamericanos a múltiples países en todo el mundo, esta patología ahora debe ser considerada una enfermedad global.

En Colombia, la prevalencia de infección por T. cruzi es de alrededor del 5%, correspondiente a 700,000 personas, y, en algunas áreas del departamento de Santander, la seroprevalencia es de cerca del 50%. Las manifestaciones clínicas de la EC incluyen una fase aguda y una crónica, la cual se presenta con un amplio espectro de manifestaciones con formas cardíacas, digestivas y neurológicas. Sin embargo, sólo aproximadamente entre un 20-30% de los individuos infectados desarrolla la cardiomiopatía chagásica crónica y/o el megaesófago/megacolon.

El diagnóstico de infección con T. cruzi es complejo, especialmente durante la fase crónica, debido a la ausencia de síntomas y a la parasitemia baja o intermitente2 que hace que los métodos parasitológicos directos tengan  baja sensibilidad. Por esta razón, el diagnóstico se basa en métodos serológicos, los cuales detectan la presencia de anticuerpos específicos  dirigidos contra antígenos de T. cruzi combinados con hallazgos clínicos y epidemiológicos. Sin embargo, las pruebas serológicas presentan alta sensibilidad, pero poca especificidad por reacciones cruzadas con otros parásitos como Leishmania sp. y T. rangeli. En este escenario, la Organización Panamericana de Salud (OPS) sugirió que por lo menos dos ensayos basados en diferentes técnicas deberían ser usados en paralelo para aumentar la precisión diagnóstica porque un solo ensayo no es considerado lo suficientemente sensible y específico. Pero esta estrategia ha llevado a un aumento en el número de resultados inconclusos que dificultan el manejo clínico de estos casos. Además, el diagnóstico correcto no sólo es una prioridad para identificar a los individuos que deben recibir un tratamiento adecuado, sino, también, para reducir y prevenir el riesgo de transmisión a través de trasfusiones de sangre y/o trasplante de órganos.

Los métodos inmunológicos se basan en el ensayo inmunoenzimático (ELISA), ensayo de hemaglutinación indirecta (HAI), inmunofluorescencia  indirecta (IFI), ensayo de inmunotransferencia (IB) y ensayo inmunocromatográfico (IC). La mayoría de los ensayos usan como antígeno lisados  crudos del parásito; sin embargo, se ha descrito el uso de proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos para aumentar la especificidad de las  pruebas. A pesar de que los métodos inmunológicos se usan en el diagnóstico de la infección por T. cruzi, los métodos moleculares proporcionan una alternativa, especialmente en casos de serología dudosa. Estos métodos están basados, principalmente, en la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, el ensayo de PCR anidada (PCR-A)10, el ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real  (PCR-RTQ), y el ensayo de oligocromatografía (OligoC) se han realizado para mejorar la detección de ADN de T. cruzi. Dada la heterogeneidad  de los resultados reportados de las pruebas disponibles para el diagnóstico, el objetivo de este estudio fue comparar la precisión de los métodos  serológicos y moleculares para detectar la infección por T cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica.

Materiales y Métodos

Población y muestras del estudio

El estudio es analítico con diseño de casos y controles, que incluyó un total de 205 personas. En el estudio, los individuos fueron seleccionados de  una base de datos de aproximadamente 2,000 pacientes que habían sido reclutados para un estudio de epidemiología molecular de la EC, realizado  por nuestro grupo de investigación durante los últimos 10 años. La base de datos cuenta con datos epidemiológicos, clínicos, de laboratorio y la información de cada participante. La recolección de los datos epidemiológicos se llevó a cabo cara a cara por entrevistadores entrenados con independencia del personal médico que elaboró el cuestionario. El diagnóstico clínico fue establecido por consenso por un panel independiente formado por dos médicos cardiólogos. Con el fin de conocer el valor diagnóstico de cada prueba serológica y molecular para la detección de T. cruzi y porque no existe una prueba estándar de oro para el diagnóstico de la EC, la selección de los individuos se realizó mediante la combinación de características epidemiológicas y clínicas. Por lo tanto, los criterios de inclusión para el grupo de los pacientes con miocardiopatía chagásica (n= 100) fueron personas de zonas rurales en las que el nivel de endemicidad es elevado, con cardiomiopatía claramente compatible con EC por electrocardiograma, ecocardiograma y Holter de 24 h; mientras que las personas sin signos y síntomas cardíacos y provenientes de una zona urbana no endémica conformaron el grupo control (n= 105).

Además, todas las personas vivieron en estas áreas por 10 o más años. La recolección de las muestras fue así: a cada persona se le tomaron tres  muestras de sangre; una de éstas (6 mL) se utilizó para obtener suero y las otras dos (4 mL cada una y con anticoagulante EDTA) para aislar el  ADN genómico a partir de la capa leucocitaria. El tiempo y temperatura de almacenamiento entre la recolección de la sangre y la extracción de ADN que de 48 h a 4° C. Las muestras de suero y de ADN se almacenaron por congelación a -70 y -20° C, respectivamente, hasta la realización del ensayo. Estas muestras se utilizaron para evaluar el rendimiento diagnóstico de los métodos serológicos y moleculares para detectar la infección por T. cruzi. Las pruebas de laboratorio fueron realizadas por dos profesionales expertos en Microbiología, quienes no conocían la información de los individuos. Dos investigadores, que tampoco conocían la información de los individuos, revisaron los resultados de las pruebas de laboratorio. Los miembros del panel revisaron individualmente cada prueba de laboratorio antes de reunirse para acordar un resultado final.

Todas las pruebas de laboratorio fueron asignadas correctamente, con 100% de concordancia entre los miembros del panel.

Métodos serológicos

Los anticuerpos anti-T. cruzi en suero fueron determinados mediante Elisa casero y recombinante, HAI y las pruebas de IC.

El ELISA casero se realizó en placas de microtitulación de 96 pocillos (Dynatech sistema micro ELISA; Alemania) con extracto soluble de epimastigotes de una cepa autóctona de T. cruzi I (MHOM/CO/06/338).

Las placas se recubrieron con 100 μL de 2.0 μg mL-1 de antígeno diluido en tampón de carbonato – bicarbonato, pH 9.6, por pocillo y se incubaron durante la noche a 4°C. Después las placas se lavaron con Tween 20 (0.05 %) en solución salina tamponada con fosfato (137 mM de NaCl, 2.68 mM de KCl, 1.47 mM de Na2HPO4, y 9.03 mM de KH2PO4•2H2O), pH 7.4 (PBS-T20). Las placas se loquearon con 2 % de leche descremada en PBS-T20. Cada muestra fue probada en duplicado con 100 μL de suero diluido 1:800 en PBS-T20. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron de nuevo. Posteriormente, se añadieron 100 μL de conjugado de anti-inmunoglobulina humana polivalente (α, γ y μ específica) marcada con fosfatasa alcalina: Cat. no.

A3313 (Sigma-Aldrich, Inc.; EE.UU.), diluido 1:6,000 en PBS-T20. Las placas se incubaron durante 1 h a 37°C y nuevamente fueron lavadas.

Después de la incubación y el lavado, se añadieron 100 μL de 1 mg mL-1 de p-nitrofenil fosfato (Sigma-Aldrich, Inc.; EE.UU.) preparado en tampón de dietanolamina al 10 %, pH 9.7. Las placas se  incubaron durante 25 min a temperatura ambiente. Finalmente, se detuvo la reacción con 50 μL de 3 M de NaOH. La densidad óptica (DO) a 410 nm se midió en un lector de microplacas modelo MR550 (Bio-Rad Laboratories, Inc.; EE.UU.). Una muestra se consideró positiva si la DO fue igual o superior a 0.37. Este punto de corte se estimó con base en el análisis de la curva ROC. El punto de corte óptimo se definió como el valor que maximiza el área bajo la curva ROC (Figura 1A).

Todas las muestras se ensayaron también por BioELISA Chagas (Biokit; España), que utilizó como antígeno péptidos sintéticos TcD, TcE, PEP2 y  TCLi1-2 y por Chagatest ELISA recombinante V.3.0 (Winer laboratorio;  Argentina), que utilizó como antígeno las proteínas recombinantes Ag1, Ag2, g13, Ag30, Ag36, y SAPA. Otras pruebas usadas fueron: Chagatest HAI (Winer Lab; Argentina.), que utilizó como antígeno eritrocitos de oveja sensibilizados con lisado de parásitos y la prueba de IC, que incluyó, como antígeno, los antígenos recombinantes H49 y 1F8 (Chagas AB rapid,  Standard Diagnostics; Corea). Todas las determinaciones de los kits comerciales se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Métodos moleculares

El ADN genómico se aisló mediante el método de “salting-out” a partir de la capa de leucocitos tomados de los 4 mL de sangre anticoagulada con  EDTA13. El ADN nuclear y del kinetoplasto de T. cruzi fueron amplificados mediante el método de PCR con el termociclador PTC-200 ® Thermal  Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc.; EE.UU.). El límite de detección del ADN de T. cruzi para los protocolos de PCR optimizados se estimó en 10  parásitos por 100 μg μL-1 de ADN total aislado. Esta concentración se determinó mediante la mezcla de muestras de sangre anticoagulada con  EDTA de una persona sana (no infectada por T. cruzi) con 1 mL de epimastigotes de T. cruzi I. Las mezclas ensayadas fueron: 1,000, 100, 10, 1,  0.1, 0.01 y 0.001 parásitos en 4 mL de sangre total. El ADN genómico se aisló de la capa leucocitaria, como se mencionó anteriormente y  diferentes concentraciones de ADN se probaron en cada ensayo de PCR. Los experimentos se realizaron por triplicado en tres ocasiones  independientes.

La secuencia de ADN nuclear (ADNn) de T. cruzi repetida en “tándem” fue amplificada utilizando los cebadores Tcz1 (5’-CGA GCT  CTT GCC CAC ACG GGT GCT-3 ‘) y Tcz2 (5’-CCT CCA AGC AGC GGA TTC TAG AGG-3‘) que amplificaron un fragmento de 188 pb ~ durante 30  ciclos (94° C por 30 s, 55° C por 30 s, 72° C por 30 s). Cada PCR contenía 0.5 M de cada cebador, 2 mM de MgCl2, 200 mM de dNTPs, 1X tampón de Taq y 1 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen Brasil Ltda., Brasil).

La región variable del ADN del minicírculo del kinetoplasto (kDNA) fue amplificada por los cebadores 121 (5’-AAA TAA TGT ACG GGK GAG ATG CAT GA-3 ‘) y 122 (5’-GGT TCG ATT GGG GTT GGT GTA ATA TA-3‘) que amplificaron un fragmento de 330 pb ~ durante 35 ciclos (94° C por 1 min, 63.5° C por 1 min, 72° C por 1 min). Cada reacción contenía 0.5 M de cada cebador, 4.5 mM de MgCl2, 200 mM de dNTPs, 1X tampón de Taq y 1.25 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen Brasil Ltda., Brasil).

Las  condiciones de amplificación de las PCR se llevaron a cabo con 800 ng de ADN molde en un volumen total de 20 μL. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio en tampón TAE 1X. Cada amplicón fue reconocido de acuerdo  con su tamaño, comparado con el marcador de peso molecular XIV (Roche Applied Science; EE.UU.). Todas las etapas de extracción de ADN y las  mezclas de reacción usadas para los ensayos de PCR se controlaron y se compararon con controles positivos y negativos; los controles positivos  incluyeron ADN aislado de la cepa de T. cruzi Silvio X-10 y el ADN aislado de la sangre infectada con dos cepas de T. cruzi I (MHOM/CO/07/REM y  MHOM/CO/07/338); mientras que los controles negativos incluyeron ADN aislado de T. rangeli, Leishmania panamensis, Toxoplasma gondii, Crithidia lucillae y ADN aislado de la sangre no infectada con T. cruzi.

Discusión

En la fase crónica de la EC el diagnóstico se basa en la presencia de anticuerpos contra T. cruzi debido a la ausencia o baja parasitemia; por lo tanto, comúnmente se utilizan pruebas serológicas como ELISA, IFI y HAI. Con el fin de resolver los inconvenientes de resultados falsos negativos y  falsos positivos con las pruebas serológicas convencionales, se han desarrollado ensayos serológicos no convencionales con proteínas  recombinantes de T. cruzi, las cuales tienen valores de sensibilidad y especificidad cercanos al 100% 7-9,16. A pesar de estos avances, y dado que  actualmente no hay disponible ninguna prueba de referencia, la OPS recomienda el uso de dos pruebas basadas en diferentes principios para detectar antígenos6. Sin embargo, esta recomendación ha incrementado los resultados discordantes y las dificultades en el diagnóstico. Además, existen numerosas pruebas disponibles en el mercado, pero con una significativa heterogeneidad relacionada con su exactitud, lo cual dificulta la selección de la más adecuada para garantizar el diagnóstico en zonas endémicas.

La evidencia experimental de este estudio muestra que BioELISA  Chagas y Chagatest ELISA recombinante V 3.0 presentaron los valores más altos de sensibilidad y especificidad, así como VPP y VPN.  Además, tienen una buena capacidad discriminatoria y alta calidad de la sensibilidad y la especificidad; además de la capacidad para confirmar y  excluir el diagnóstico de la infección por T. cruzi en pacientes en fase crónica de la EC. Sin embargo, a pesar de que el nivel de correlación es alto los resultados obtenidos mediante el uso de BioELISA Chagas fueron mejores que con Chagatest ELISA  recombinante v. 3.0, como ha sido reportado en estudios previos en Colombia en los que este último mostró 95% de sensibilidad17. Esto podría ser explicado por diferencias en la composición y mezcla de péptidos sintéticos o proteínas recombinantes de T. cruzi . Así, el  BioELISA Chagas incluye los péptidos sintéticos TcD, TcE, PEP2 y TCLi1-2 (www.biokit.com), con el modelo de epítopes antigénicos inmunodominantes de T. cruzi 18; mientras que, Chagatest ELISA recombinante v.3.0 incluye las proteínas recombinantes Ag1, Ag2, Ag13, Ag30, Ag36, y SAPA (www.wiener-lab.com.ar). Las características de sensibilidad y especificidad de cada péptido/proteína y sus mezclas fueron revisados previamente por Jose Franco da Silveira9. Sin embargo, es importante señalar que ambas pruebas muestran altos niveles de correlación entre sí; por otra parte, exhiben antígenos reconocidos principalmente por anticuerpos de la clase de IgM, tales como TCLi1-2 y SAPA. Sin embargo, en la  reacción antígeno – anticuerpo en la prueba BioELISA Chagas se identifican anticuerpos de la clase de IgG e IgM humana, mientras que el  Chagatest ELISA recombinante v.3.0 sólo identifica IgG humana. Por el contrario, el ensayo inmunocromatográfico de Chagas AB rapid es una prueba diagnóstica rápida que utiliza los antígenos recombinantes H49 y 1F8 que han demostrado valores de sensibilidad y especificidad de 97-100% 16,19. Esta evidencia puede explicar los buenos resultados obtenidos en sensibilidad, especificidad, VPP, VPN, calidad de la sensibilidad, calidad de la especificidad y la capacidad discriminatoria. Además, su simplicidad y facilidad de interpretación hacen que sea muy útil en el diagnóstico rápido de infección por T. cruzi en estudios de campo. Sin embargo, para los sujetos con resultados negativos sería necesario el uso de cualquiera de las otras pruebas para realizar el diagnóstico de infección por T. cruzi. Por otro lado, el ELISA casero y la HAI exhiben altos valores de sensibilidad, especificidad, VPP y VPN.

Sin embargo, el ELISA casero tiene mejores valores de sensibilidad y VPN que el Chagatest HAI, mientras Chagatest HAI tiene mejores valores de  especificidad y VPP que el ELISA casero (Tabla 1); además, el ELISA casero presentó mayor capacidad discriminatoria y capacidad para confirmar  y descartar el diagnóstico de la infección por T. cruzi. Estas pruebas mostraron falsos positivos y negativos, lo cual podría ser resuelto o mejorarse con el uso de las preparaciones antigénicas de tripomastigotes y/o amastigotes de cepas autóctonas de T. cruzi.

La detección de T. cruzi en muestras de sangre humana mediante amplificación de ADN con métodos basados en PCR ha sido aplicado para  diagnosticar EC en pacientes, quienes han progresado a la fase crónica.

Pero, dado que durante esta fase el número de parásitos que circula en sangre periférica es bajo o intermitente, los métodos basados en la PCR tienen sensibilidades del orden de 45-65 %, mientras que la especificidad se mantiene cerca del 100 % 5, 20,21. Aunque las secuencias diana utilizadas en este estudio tienen un alto número de copias en el genoma de T. cruzi (5,000 a 10,000 copias de ADNk y ~ 10% de ADNn por parásito) 22,23, los resultados mostraron moderados a bajos valores de sensibilidad y calidad de sensibilidad para ensayos de PCR realizadas con los cebadores 121/122 y Tcz1/Tcz2. Estos resultados se podrían explicar, al menos en parte, por la disponibilidad de ADN molde en la mezcla de reacción, que podría estar relacionada con el tipo de cepa de T. cruzi. Así, se observan diferencias en el número de copias de ADN satélite blanco, entre las cepas de T. cruzi que son más abundantes en T. cruzi II que en T. cruzi I 24, así como hay diferencias en el nivel de parasitemia, que es mayor en infección por T. cruzi I comparada con T. cruzi II 20. Estos resultados son relevantes porque en Colombia T. cruzi I es el grupo predominante, tanto en el ciclo doméstico como selvático, pero hay evidencia de  infección por T. cruzi II en pacientes con cardiopatía chagásica 25. Estos resultados muestran que pacientes con un resultado positivo de PCR pueden ser diagnosticados como infectados por T. cruzi, pero para los pacientes con un resultado PCR negativo será necesario el uso de cualquiera de las otras pruebas para realizar el diagnóstico de infección por T. cruzi. Esto indica que las pruebas moleculares pueden confirmar el diagnóstico,  pero no excluirlo (Figura 1C). De hecho, estas pruebas moleculares mostraron de moderada a baja correlación con las demás pruebas.

En conclusión, nuestra evidencia experimental sugiere que la estrategia de diagnóstico de la infección por T. cruzi en pacientes que han progresado a la fase crónica de EC se puede hacer mediante el uso de BioELISA Chagas o Chagatest ELISA recombinante v.3.0, que no sólo mostraron un  mejor rendimiento diagnóstico, sino que también pueden confirmar y excluir el diagnóstico de la infección por T. cruzi. Por otra parte, Chagas AB Rapid podría ser utilizado en los casos en que sea necesario un diagnóstico rápido. Por último, los ensayos moleculares se pueden usar para  confirmar el diagnóstico; sin embargo, debido a la baja sensibilidad, especificidad y capacidad discriminatoria es importante la utilización de cualquiera de las otras pruebas para realizar el diagnóstico de la infección por T. cruzi.

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Autores

Luisa Fernanda Duarte (1), Oscar Flórez (1), Giovanna Rincón (1), Clara Isabel González* (1)

(1) Molecular Immunology and Epidemiology Group, GIEM, Facultad de Salud, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.

Colombia Médica – Vol. 45 Nº2 2014 (Abr-Jun)Colombia Médica

Correspondencia:

• Clara Isabel González Rugeles, PhD Escuela de Bacteriología, Facultad de Salud. Carrera 32 # 29-31, Oficina 419 Bucaramanga, Colombia
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